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布鲁氏菌Ery-SSCP-PCR方法

来源: 发布时间:2013-01-28

  1.特点特性:布鲁氏菌Ery- SSCP-PCR方法可区分鉴别牛种A19疫苗株与野毒株,为牛种A19疫苗株的鉴定提供了新的检测方法。

  2.技术要点:设计引物引物:Ery-(F):5’-ATGTGGACTGGTTCAAGAC CT-3’,Ery-(R):5’-TCATTATCCACCGCGCCGTC-3’,PCR反应体系:10×PCR Buffer (含Mg2+)5μL,引物各1ul(25μmol/l),10mmol/L dNTP 1μL,1U/μL Taq 酶1μL,DNA模版1μL, H2O补至50μl。PCR反应程序:95℃预变性5min;95℃ 1min,61℃ 1min,72℃ 1min进行30个循环;72℃延伸10min其余步骤按常规方法进行操作。配制12%非变性PAGE胶:29%丙烯酰胺-1%甲叉双丙烯酰胺 12ml;5xTBE 3ml;10%过硫酸铵(AP) 0.21ml;TEMED 20μl;去离子水 14.77ml。取Ery-PCR扩增产物10μl,加入变性液(0.05%二甲苯兰,0.05%溴酚蓝,0.02mol/LEDTA,加甲酰胺至10ml)20μl混匀,100℃变性10min后骤然冰浴,8min后上样于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶。0.5xTBE电泳缓冲液于4℃180V电泳20h。常规硝酸银染色显示DNA带纹。

  3.推广前景:主要用于甄别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株。该方法为家畜布病的自然感染与主动免疫提供了鉴别方法,为布鲁氏菌病流行病学调查、疫源探查、布病的防控有着及其重要的作用。

  4.适宜地区:该方法可用于全国免疫A19疫苗的牛和绵羊养殖场。